O teste de sonda: quando a plataforma desaparece

Abertura

É a quinta manhã. A piscina é a mesma, os pôsteres nas paredes são os mesmos e a água está igualmente turva. Só uma coisa mudou. Durante a noite, alguém pôs a mão lá dentro e tirou a plataforma.

Um camundongo é colocado do lado oposto. Ele parte decidido, atravessa a piscina em linha reta até um trecho de água perto da parede sudeste. Desacelera. Vira. Vai e volta sobre o ponto exato onde a plataforma costumava estar. Não há nada ali, mas ele continua procurando, em círculos cada vez mais fechados.

Para quem observa, aquele trecho de água vazio é o lugar mais interessante da sala. O camundongo está nos mostrando, da forma mais clara possível, que lembra.

O que é um teste de sonda

Este é o teste de sonda, às vezes chamado de teste de transferência. É o momento silencioso no fim do treino no labirinto aquático, quando a recompensa desaparece e a memória precisa falar por si. Por que retirar a plataforma, e como pontuar a busca por algo que não está lá?

A montagem padrão

Imagine primeiro a montagem padrão. Durante o treino, um animal aprende a encontrar uma plataforma escondida num lugar fixo, usando pistas da sala. Cada ensaio termina quando ele sobe nela. Isso é útil, mas cada ensaio também mistura duas coisas. Uma é a memória de onde a plataforma está. A outra é o ato de chegar lá, que depende da velocidade de nado, da motivação e da sorte.

O teste de sonda separa essas coisas. A plataforma é retirada, então o ensaio não pode terminar antes com uma fuga. O animal é colocado na água, muitas vezes num ponto de partida novo, e pode procurar por um tempo fixo. Trinta ou sessenta segundos são escolhas comuns. Depois ele é retirado.

O que sobra é um registro de onde ele escolheu procurar. Se aprendeu o local, sua busca deve se concentrar em torno do antigo lugar da plataforma. Se não aprendeu, sua trajetória vai se espalhar de forma mais ou menos uniforme pela piscina.

Um protocolo bastante usado sugere aplicar o teste de sonda um dia inteiro após a última sessão de treino. Assim ele mede a memória de prazo mais longo, e não só o que aconteceu minutos antes. Alguns laboratórios também incluem testes de sonda curtos durante o treino, antes do primeiro ensaio do dia, para acompanhar a formação da memória.

Repare no que o teste de sonda não precisa. Não precisa que o animal suba, nem que seja rápido, nem mesmo que esteja especialmente motivado. Só precisa que ele nade e escolha onde. Isso o torna um teste surpreendentemente suave, considerando o quanto ele pode revelar.

Parte do labirinto desde o início

O teste de sonda faz parte do labirinto aquático desde o início. Richard Morris e colegas, no início dos anos 1980, o usaram para mostrar que os ratos realmente lembravam um lugar. Um artigo de métodos que Morris publicou em 1984 desenvolveu mais o procedimento. Ele descrevia o rastreamento automático da posição de um rato a partir do vídeo e maneiras de testar memória de trabalho e aprendizagem não espacial na mesma piscina. Assim que foi possível acompanhar a trajetória de nado quadro a quadro, deu para medir exatamente onde um animal procurava.

As primeiras medidas eram sensatas e simples. Divide-se a piscina em quatro quartos imaginários, chamados quadrantes. Depois conta-se quanto do teste de sonda o animal passa no quadrante que antes tinha a plataforma. Com quatro quadrantes, o acaso é de cerca de vinte e cinco por cento. Um animal bem treinado pode passar o dobro disso.

Passe isso para segundos. Num teste de sonda de sessenta segundos, o acaso seria cerca de quinze segundos no quadrante-alvo. Um animal que passa trinta segundos ali mostra uma preferência clara. Um que passa dezesseis diz muito pouco, mesmo que seus tempos de treino parecessem bons.

A segunda medida clássica são os cruzamentos da plataforma. Desenha-se o contorno de onde a plataforma estava e conta-se quantas vezes o animal nada exatamente sobre ele. Uma boa memória deve produzir muitos cruzamentos. Uma ruim, muito poucos.

Durante anos, essas duas medidas dominaram. Até que uma pergunta começou a incomodar. Qual medida é realmente a melhor para detectar uma diferença real entre grupos de animais?

Qual medida é mais sensível?

Em 2009, Hamid Maei, Paul Frankland e colegas do Hospital for Sick Children, em Toronto, decidiram responder. Reuniram cinco bancos de dados separados, com mais de mil e seiscentos testes de sonda em camundongos. Depois simularam experimentos várias e várias vezes, sorteando animais desses bancos de dados. É uma técnica chamada simulação de Monte Carlo. Ela permitiu perguntar, repetidamente, com que frequência cada medida encontrava uma diferença real entre grupos.

Eles compararam quatro medidas. O tempo no quadrante, que já conhecemos. O tempo na zona, que usa um círculo menor centrado na antiga plataforma. Os cruzamentos. E uma quarta, chamada proximidade, que é simplesmente a distância média do animal até o local da plataforma durante todo o teste de sonda.

A vencedora foi a proximidade, com folga. Numa comparação, com quinze camundongos por grupo, a proximidade detectou a diferença entre grupos em cerca de setenta e dois por cento das vezes. O tempo no quadrante conseguiu cerca de quarenta e nove por cento. Os cruzamentos ficaram em torno de treze por cento. Já os alarmes falsos foram parecidos para as quatro.

Por que a proximidade se sairia tão melhor? Os autores deram uma explicação elegante. O tempo no quadrante e os cruzamentos foram criados quando o rastreamento era rudimentar. O tempo no quadrante descarta detalhes. Um nado logo fora da linha não conta nada, enquanto um nado no canto mais distante do quadrante certo conta por inteiro. Os cruzamentos são ainda mais duros, já que um quase acerto vale zero.

A proximidade mantém os detalhes. Cada momento do nado contribui, e estar perto vale mais do que estar longe. Pense em dois camundongos. Os dois passam trinta por cento do teste de sonda no quadrante-alvo. Um fica bem em cima do antigo local da plataforma. O outro vaga pela borda externa desse quadrante. O tempo no quadrante não consegue diferenciá-los. A proximidade consegue.

O que um bom teste de sonda mostra

Então, o que um bom teste de sonda mostra? Mostra que um animal tem memória de um local, independentemente de quão rápido chega lá. A velocidade de nado não muda onde o animal escolhe procurar. Por isso, na literatura de protocolos, um déficit no teste de sonda é visto como forte evidência de um verdadeiro problema de memória, e não de desempenho.

Ele também pode mostrar quão precisa é essa memória. Uma busca ampla e solta sugere que o animal sabe mais ou menos para onde ir. Um foco preciso no ponto exato sugere uma memória nítida e métrica. Pesquisadores interessados em efeitos sutis, como envelhecimento precoce ou alterações genéticas leves, costumam se importar sobretudo com essa diferença.

E o teste de sonda pode mostrar mudanças ao longo do tempo. Faça um no fim do treino, depois mude a plataforma para o lado oposto e treine de novo. Um segundo teste de sonda após essa reversão mostra se o animal atualizou seu mapa ou ficou preso à resposta antiga.

A mesma lógica funciona em escalas diferentes. Os pesquisadores podem comparar o alvo com cada um dos outros três quadrantes, e não só com o acaso. Uma memória forte aparece como uma barra alta e três baixas. Uma memória mais fraca pode mostrar preferência pelo alvo e pelos vizinhos, o que indica uma noção aproximada de direção sem um local preciso.

Os limites do teste de sonda

O teste de sonda não é perfeito. Para começar, todo teste de sonda é uma lição. O animal procura e não encontra nada. Faça isso com muita frequência e ele pode começar a aprender que a plataforma sumiu de vez. Os protocolos alertam justamente por isso contra fazer testes de sonda demais.

O tempo também importa dentro do ensaio. A busca costuma começar focada e depois se espalha, à medida que o animal desiste do local antigo e explora outros lugares. Algumas evidências sugerem que a preferência pelo quadrante-alvo diminui depois dos primeiros trinta segundos. Um teste de sonda de sessenta segundos pode diluir justamente o efeito que procura, por isso muitos laboratórios analisam a primeira metade separadamente.

A escolha do ponto de partida também pode enviesar os resultados. Comece um animal logo ao lado do quadrante-alvo e ele pode entrar ali por acaso. Por isso os testes de sonda costumam começar de uma posição nova, muitas vezes do lado oposto.

Há também animais que não procuram de verdade. Alguns flutuam. Alguns ficam colados à parede. Alguns nadam em círculos a uma distância fixa da borda, o que pode somar cruzamentos sem nenhum conhecimento real do lugar. Um único número-resumo pode esconder tudo isso. Olhar a trajetória real de nado, e a estratégia de busca, é a única forma de ter certeza do que o animal estava fazendo.

E a proximidade, apesar de todas as suas qualidades, tem uma ressalva. Ela depende de onde o animal começa, porque um camundongo que parte de longe carrega um primeiro trecho longo na média. Algumas análises lidam com isso ignorando os segundos iniciais ou corrigindo pela distância de partida.

De volta ao trecho vazio

De volta àquele trecho de água vazio perto da parede sudeste e ao camundongo indo e voltando sobre uma plataforma que não está lá. É uma cena estranhamente comovente. O animal age a partir de uma memória, e o teste de sonda transforma essa memória num mapa que podemos ler. O segredo é escolher uma medida que enxergue a busca inteira, e não só as partes arrumadas.

Em hvsimage.com há um guia detalhado das medidas do teste de sonda, incluindo a proximidade. Você encontra os artigos mencionados, e uma transcrição, em water-maze.com.